Клеткаларды зерттеу әдістері

Клетканың жалпы морфологиясын оқып үйрену - зерттеу әдістерінің дамуына байланысты. Цитологияның негізгі зерттеу әдісі - микроскопиялық әдіс. Казіргі кездің өзінде де жарық микроскопы зерттеу құралы ретінде өзінің маңызын жойған жок.

Оптикалық микроскопия
Биологиялық микроскоптың бірнеше модельдері бар (МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, т.т.). Бұл микроскоптар клеткалық кұрылымдарды және олардьң функциясын жан-жақты зерттеуге мүмкіншілік береді. Ең жақсы деген оптикалық микроскоптың шешуші кабілеті айтарлықтай жоғары емес. Микроскоптың шешуші кабілеті дегеніміз жеке көрінетін екі нүктенің ең кіші ара кашықтықтары. Жарық микроскопы екі нүктенің ара қашықтықтарын өсіріп көрсетеді. Бұл әйнек линзаларының немесе линзалар жүйесі көмегімен іске асады. Әйнек жүйелерінің бірі объектив, карайтын нәрсенің (обьектінің) көрінісін кұрайды, ал окуляр деп аталатын екінші жүйе оны қайтадан үлкейтеді. Окуляры көзге жақын орналасқан линза дейді. Микроскопта жарықты жинаушы конденсор болады. Оптикалық микроскоптың шешуші кабілеті 0,2 мкм немесе 200 нм (нанометрге) тең, ал адам көзінің шешуші кабілеті 0,1 мм. Жарық көзі ретінде ультракүлгін сәулелерді қолданған кезде оптикалық микроскоптың шешуші қабілетінің шегі 0,1 мкм жетеді, яғни екі есе артады. Ультракүлгін сәулелерді адамның көзі кабылдай алмайтын болғандықтан, клетка кұрылысының көрінісі фотоға немесе эқранға түсіріледі.

Микроскоптың үлкейту дәрежесі объектив пен окулярдың үлкейтуіне тәуелді, сан жағынан олардың үлкейту шамаларының көбейтіндісіне тең. Казіргі оптикалық микроскоптың үлкейту шегі 1500 еседен артпайды.

Тірі  материал  мөлдір  және  жеке  клеткалардың  қалың   болуына байланысты зерттеуге қолайсыз. Сондықтан көбінесе фиксацияланған (бекітілген) материалмен жұмыс істелінеді. Одан жұқа кесінділер дайындап, түрлі бояғыштармен бояйды. Калындығы 5-10 мкм-дей кесіндіні арнайы микротомдар арқылы дайыңдайды. Сапалы бекіту объектінің тірі күйіндегі құрылымын айтарлықтай өзгертпейді.  Бекітуі ұлпаны тығыздайды  және  автолиз  процестерін  тоқтатады.   Кейбір  бекітуші сұйықтар белгілі кұрылымдардың бояулар мен боялу кабілетін арттырады. Жиі қолданылатын бекіткіштер формальдегид, қосхромдық қышқыл калий, сірке, пикрин және осмий қьшқылдары мен этил, спирті.  Сұйық қоспалар жақсы бекіткіштер деп саналады. Олардың көпшілігі   ұсынған   зерттеушілердің   аттарымен    аталған.  Бекіткеннен кейін объектіні ұлпаға сіңетін ортаға батырады . Тығыздаушы заттар жақсы сіңу үшін ұлпаның бөлшегінен этил спиртінің көмегімен суды ығыстырып шығарады, содан кейін ксилолға немесе толуолға салады. Алдын ала істелетін бұл екі кезең ұлпаға парафин сіңу үшін кажет. Жылы сүйық парафин сіңеді де катып қалады. Микротомның көмегімен   парафин   блогінен   шыныға   бекитін   жұқа   кесінділер дайындайды. Кесіңдіден парафинді ксилолдың көмегімен ығыстырып шығарады. Осыдан кейін кесіңдіні бояйды.  Көбінесе ұлпаны гемотоксилин және эозинмен бояйды. Гемотоксилинмен боялатьш құрылымдарды базафильдік деп атайды. Эозин қышқыл бояу сондықтан оны байланыстыратын клетканың компоненттерін ацидофилдік немесе эозинафильдік дейді. Осы кұрылымдарды тірі клеткаларда белсеңділік күйіңде көру үшін әр турлі микроскоптарды шығарған: фаза - конт-растық, поляризациялық, флуоресценттік тағы баскаларын. Бұл мик-роскоптардың бәрі жарықты пайдалануға негізделген.

Ивтерференииялық микроскопия
Интерференциялық микрокопиялық әдіс фазалық-контрасты  микроскопия өдісіне ұксас. Боялмаған мөлдір Іірі клеткалардьщ анық көрінісін алуга мүмкіншшк береді. Жарық көзінен шығатын параллель жарық  сәулелерінің шоғы екі бұтаққа  бөлінеді - үстіңгі және астыңғы. Төменгі бұтақ препарат аркылы өтеді және оның жарық тербелісінің фазасы өзгереді, ал жоғарғы толқьн өзгермейді. Объективтің призмасьнда  екі бұтақ кайтадан қосылады да өзара ингерференцияланады. Осының нэтижесінде препараттың калындығы  әр түрлі участоктың әралуан түске бояльш жақсы көрінетін болады.

Поляризациялық микроскопия
Поляризациялық микроскопия әдісі ұлпалар мен клеткалардың түрлі компоненттерінің поляризацияланған жарықтың сынатьн қабілетіне негізделген. Кейбір клеткалық кұрылымдар (бөліну ұршығының жіптерінің, миофибриллалардың, жыбырлауық эпителийдің кірпікшелерінің жөне т.б.) молекулаларының катаң дұрыс орналасуымен сипатталады және осыған қоса сәуленің сынуы да осы касиетіне төн. Мүндай құрылымдарды анизотропты кұрылымдар деп атайды.

Анизотропты кұрылымдарды поляризациялық микроскоптың көмегімен зерттейді. Оның биологиялық микроскоптан айырмасы коңденсордың алдында поляризатор орналаскан, коңденсатор мен анализатор препарат пен обьективтен кейінорнатылған. Поляризатор мен анализатор Ислаңдия апатитінен жасалған призмалар. Поляризациялық микроскопта анизатропты объекгілер караңғы өрісте жарық шығарады. Флуоресцентік (люминсцентгік) микроскопия әдісі де тірі клеткаларды зерттеу үшін колданылады. Бұл әдіс кейбір заттардың жарық сәулелерінің әсерімен жарық шығаратън касиетіне негізделген. Қозған жарық толқындарының  ұзындығы жарық көзі толқындарының ұзындығынан артық келеді. Жарық көзі ретінде көк немесе ультракүлгін сәулелерді пайдаланады. Клеткадағы көптеген құрылымдар мен заттардың флуоресценцияланатън (жарық бөлетін) қабілеті болады, мысалы өсімдіктер клеткаларының хлоропластылардағы жасыл  пигмент хяорофилдің ашық-қызыл  жарық бөлетін касиеті бар. А және В виааминдер де, бакгерия клеткаларының кейбір пигменттері де жарық шығарады. Бірақ та клеткалардағы затардың көпшілігінің мұңдай касиеті болмайды. Ондай заттар жарық бөлу ұшін оларды флуорохромдармен, люминесцентік бояғыштармен өңдеу керек. Бұған жататъндар қызыл-сары акридин, берберин, сульфат, флоксин, т.б. флусрохроматгардың көпшілігі жеке клеткалық құрылымдарды жаппай бояй бермейді, белгілі туске тандап бояйды. Мысалы, қызғылт-сары акридин дезоксирибонуклеин қышқылын (ДНК) жасыл, ал рибонуклеин қышқылын (РНК) қызғылт-сары түске бояйды. Поляризациялық микроскоптың көмегімен зерттелетін анизатропты құрылымдардағы молекулаладың орналасуын  анықтауға болады.

Қараңғы  өрістегі микроскопия
Қараңгы өрісте препараттарды  ерекше  ковденсатордьң  көмегімен зерттейді.  Жарық өрісінің ковденсаторынан караңғы өрістік конденсатордың айырмасы жарық көзінен жанама шеткі сәулелерін ғана өткізеді. Жарықтың шеткі сөулелері обьективке түскендіктен микроскоптың  көру өрісі қараңғы күйіңде калады да, ал шашыраңкы жарық түскен объекті байқалатьн болады. Қараңғы өрісте түрлі тірі клеткаларды байкауға болады.

Фазасы қарама-қарсы микроскопия
Тірі клетканы зерттеуге фазасы қарама-қарсы микроскопты қолданады. Боялмаған тірі биологиялық обьектілер жарықты сіңірмейді, түссіз мөлдір болады, яғни жарық толқынының амплитудасьн өзгертпейді, алайда оның фазасьн өзгертеді. Адамньң көзі фазалық өзгерістерді байқай алмайды. Фазасы қарама-қарсы әдісі осы препараттар бейнесінің айқын  көрінуін камтамасыз етеді. Микроскоптың бұп түрінде конденсорге арнаулы сақина тәрізді диафрагма, объективке фазалық пластинка орнатылады. Микроскоп оптикасының мұндай конструкциясы боялмаған препарат арқылы өткен, көздің қабылдай алмайтын жарық фазасының өзгерістерін, амплигудасы әр түрлі жарық тербелісіне айналдырады. Осының нәтижесінде препараттың бейнесі көзге анық көрінеді.

Электроңдық микроскопия
Электронды микроскопты 1951 жылы неміс ғалымдары Девиссон мен Калбин  құрастырған. Электрондық микроскоптың көру, анықтау кабілеті өте жоғары. Электрондық микроскоп жарық микроскопына карағанда 100 000 есе үлкейтеді. Қазіргі электронды микроскоптың көрсеткіштік кабілеттілігі 0,1-0,3 нм-ге дейін жетеді. Объектіні 150 000 есеге дейін үлкейтеді. Клетканың барлық ультрақұрылысын  молекулалық деңгейде зерттеуге мүмкіншілік береді.
Электрондық микроскоптың  кұрылысы жарық микроскопына ұқсас, сәулелерінің ролін электр тогімен қыздырылған вакуумда орналаскан вольфрам жібінен тарайтын электрондар тасқыны аткарады, өйнек лин-заларының орныңца электромашитгер болады. Жарық микроскопының обьективі мен окулярьша электрондық микроскопга машипік катуш-калар сәйкес келеді.
Электрондық микроскопта міндетті түрде вакуум болуы кажет, себебі ауада элекгрондар алыска кете алмайды, оттегі, азот немесе көмір қышқыл газы молекулалармен кездессе, олар бөгеліп өз жолын өзгертіп шашырап кетеді. Электрондар таскынының  бағытын кажетіне карай куатгы электр немесе машит өрісімен өзгертуге болады.
Электрондардың жылдамдығын үдетсе электроңдық микроскоптың шешуші кабілеті артады. Техникалық тұрғыдан казіргі кезде бұл киьн мәселе емес. Токтың кернеуі 40000-100 000 вольт болса, электрондар жылдамдығы секундына 200 000 км-ге дейін жетеді.
Препарат тығыз болса көрінбейді. Ең кішкене клетканың, мысалы бактериялық клетканың көлденең кесіндісі 1 мкм. Мұңдай калыңдықтан еш-бір электрон өте алмайды. Сондықтан экранда кара дақ кана пайда болады. Зерттелетін клетканы өте кішкене бөліктерге бөлу кажет. Мүндай кесінділердің калыңдығы 100 нм-ден аспауы керек. Өте жұқа  кесінділерді ультрамикротомдармен дайындайды Электрондық микроскоппен зерттеу үшін ұлпалар бөліктерін жарық микроскопымен зерттегендей өндеуден өткізеді. Бекітуді ерекше ұқыптылықпен жүргізу керек, себебі микромолекулалық деңгейге дейнгі клетканың құрылысын сақтау қажет.
Көбінесе екі рет бекітуден өткізеді, алдымен глутаральдегидте немесе формальдегидте, кейін осмий ангидртгінің ерітіндісінде бекітеді. Сіңіру ортасы ретінде жасаңды смола аралдит немесе эпон қолданылыады. Калыңдығы 50-100 нм кесіңдіні әйнек немесе алмаз пышақтармен дайындайды.  Зерттелетін обьектінің көрінісі элекгроңдарга сезімтал фотопластинкаға  немесе флуоросценциялаушы экранга түседі. Элекгроңдық микроскоптың  бірнеше түрі бар: трансмиссиялық, растрлық, жоғарғы вольттік.

Авторадиография әдісі
Авторадиография  әдісі  метаболизмдік  процестердің  динамикасын  зерттеуге мүмкіншілік береді. Радиоактивтік изотоптармен таңбаланған молекулаларды, мысалы фосфордың (Р32), көміртегінің (С 14), сутегінің   тритийдің (Н3) изотоптарын  тағамға қосьш немесе инъекция аркылы  организмге енгізеді. Сіңген радиоактивтік молекулалар клетканың белгілі бөлімдерімен химиялық реакцияларға түседі, ал радиоизотоптардын, бар  жерін   авторадиография   әдісімен   анықтайды.   Ол   үшін   препаратты фотюмульсияның  жұка кабатымен жабады. Радиоакивтік изотоптар ыдыраган кезде бөлінетін сәулелер немесе бөлшектер эмульсия арқылы өтіп, қара түйіршіктер құрайды.

ЦИТОХИМИЯЛЫҚ ӘДІС.

Цитохимиялық әдістер түрлі заттардың клеткада орналасуын және  арнаулы кұралдар арқылы олардың санын анықтауға мүмкіндік береді. Бұл әдісте тұрлі реактивтерді қолданып, клетканың кұрамындағы заттарга сапалық химиялық реакциялар жүргізеді.  Белоктарды, нуклеин қышқылдарьн, майларды, көмірсуларды, гормондарды, витаминдерді,ферменттерді, металдарды, т.б, анықтайтын әдістер бар.  Цито және гистохимиялық  әдістер   мұздатылған   кесінділерді   бояу   кезінде   жиі қолданьлады,  алайда  парафинді  кесінділерді де  бояуға  пайдалануга болады. Соңғы жылдары цито-гастохимиялық тәсілдерді электрондық микроскопиялық әдіспен бірге жүргізу болашагы мол жаңа бағыттың — электрондық цито-гисто-химияның дамуьна әкеліп соқты. Қазіргі кезде сапалық тәсілдермен бірге ұлпалар мен клеткалардағы түрлі заттардың мөлшерін анықтайтын  сандық цито-гистохимиялық әдістер қодданылып жүр. Липидтерді зерттеген кезде бекітілген ұлпаны парафиндеуге болмайды, себебі спирттер арқылы өткізген кезде липидтер ериді. Сондықтан оны криостатта мұздатылған күйде кесу керек. Этил спиртінде сусыздандыру ұлпаның көлемін кемітеді. Суды лиофилизация (мұздатылған күйінде кептіру) әдісімен жоюға болады. Үлпаны тез мұздатады (мысалы: сүйық азотпен),  содан кейін төменгі температурада вакуумде сусыздандырады. Лиофилизацияланған ұлпаның бөлігін формальдегид буында бекітеді де парафинге салады, Биологиялық жұйелердің кұрылысы мен функциясы жөніндегі толық мәліметтерді алу үшін кұрылымдарды тірі күйінде зерттеу керек.

Ұлпаларды қолдан өсіру әдісі.
Ұлпалар мен клеткаларды қолдан өсіріп, зерттеуді организмнен тыс және организмнің өзінің құрамында  жүргізуге болады. Ұлпалар мен клеткаларды қолдан өсіру әдісінде клеткалар мен ұталарды стерилдік жағдайда арнаулы қоректік ортада шыны камераларда организмнен тыс өсіреді. Осы кезде клеткалар тірі клеткалардың негізгі касиеттерін ұзақ уақыт (10 жылға дейін, тіпті одан да көп) сақтайды. Тірі клеткаларды кинопленкаға түсіріп алуға да болады. Өсімдікгер ұлпаларын  бірінші болып  қолдан өсіргендер - неміс гистологі Фехтинг (1892), неміс ботанигі Рехтингер (1893) жөне неміс ботанигі Габерландт (1902), ал жануарлар үлпаларын американдық Гаррисон (1907) және американдық биолог Каррель (1911) өсірген.

Микрохирургия немесе микрургия әдісі
Тірі клеткаларды зерттеу мақсатыңда микрохирургия немесе микрургия әдісінде қолданады. Микроманипулятор деп аталатын кұралмен клетканы кеседі, ішінен бөлікгерін шыгарьш алады. Операцияның барысын  микроскоп арқылы байкайды. Микрохирургиялық құралдар өте  кішкентай шыны қармақтар, инелер, капиллярлар. Микроманипуляцияны  арнаулы камераларда жүргізеді.

Рентгенструктуралық талдау әдісі
Рентгенструктуралық талдау әдісі рентген сәулелердің дифракция  құбылысына негізделген цитоплазма мен ядроның кұрамына кіретін белокьардың, нуклеин қышқылдарының және баска заттар молекулаларының құрылысын  зерттеу үшін қолданылады. Бұл тәсіл молекулалардың  кеңістіктегі орналасуын  анықтауға, олардың аракашықтықгарын  өлшеуге мүмкіндік береді.